Помилки виділення ДНК/РНК – причина невдалих результатів ПЛР тестів

Нуклеїнова кислота-мішень не повинна містити домішок, оскільки якість і цілісність виділеної нуклеїнової кислоти впливає на результати всіх подальших досліджень та чутливості/спеціфічності ПЛР реагентів.

Крім того, при виділенні РНК необхідно розуміти, що вона є нестабільною молекулою з дуже коротким періодом напіврозпаду після виділення з тканин-мішеней. Тому особлива обережність необхідна виділення РНК через її сприйнятливість до деградації. Вона нестабільна через присутність ферментів (РНКаз), присутніх у крові та тканинах. Для виділення РНК необхідний валідований лабораторний метод.

Що важливо ?

Як правило, лаборанту необхідно якісно виконати чотири важливі етапи для надійного очищення нуклеїнових кислот:

 Ефективне руйнування клітин чи тканин

 Дегенерація нуклеопротеїдних комплексів

 Інактивація нуклеаз

 Запобігання пробі від забруднення домішками (контамінації)

Для контролю всіх чотирьох етапів очищення, ПЛР - лабораторії обов'язково використовують процедури постановки з кожним тестом спеціальних універсальних

контролів екстракції та амплифікаціі (IC) та контролі контамінації (негативний контроль, використовується як контроль контамінації при екстракції ПК з клінічного

матеріалу)

Використання IC запобігає генерації хибно негативних результатів, пов'язаних з можливою втратою ПК під час підготовки зразка та вказує, чи присутні інгібітори ПЛР у реакційних сумішах. IC слід додати до шкірного зразка (включаючи контрольні зразки) перед процедурою вилучення ПК. Ампліфікація та екстракція з IC не впливає на чутливість або специфічність ПЛР цільової ПК.

Сучасні методи виделення НК

На сьогоднішній день одними з найбільш ефективних методик очищення нуклеїнових кислот з різних типів біологічного матеріалу для кількісних та геномних методик є

метод сорбції, вперше розроблений Вільямом Р. Бумом, та його модифікації на магнітних частинках (не потрібно центрифугування, простіші операції) та швидкісний

метод на спин-колонках.

Для якісних тестів залишаються актуальними простіші методи: преципітація (DNA/RNA-Prep, Sacace) та метод з використанням лугів для виділення ДНК (GENEKAM), який на сьогодні є найбільш економічним методом вилучення з клінічного матеріалу та спеціального фільтрувального паперу 903 з нанесеним рідким клінічним матеріалом.

Метод Boom, або метод вилучення нуклеїнових кислот Boom, є методом твердофазної екстракції для виділення нуклеїнових кислот з розчину біологічного матеріалу. Метод Буму використовує магнітні кульки, покриті кремнеземом (SiO2), які пов'язують нуклеїнові кислоти. Ключем до процесу є використання хаотропного агента.

Зразок необхідно обробити, щоб забезпечити вивільнення нуклеїнових кислот розчин. Клітини необхідно лізувати з допомогою спеціального буфера для лізису, званого

хаотропним агентом ( див. нижче ). Біологічний зразок піпеткою переноситься в пробірку, що містить гранули кремнезему та хаотропний агент. Тепер у вас вихідний

матеріал. Хаотропний агент розчиняє клітини та вірусні частинки, призводячи до вивільнення нуклеїнових кислот у розчин, які під дією того ж хаотропного агента

вибірково сорбуються на поверхні кремнезему. Інгібітори та інші компоненти клінічного матеріалу залишаються у розчині. За допомогою центрифугування

кремнезем з ПК осідають, а супернатант з інгібіторами ПЛР видаляється. Серія наступних відмивок забезпечує одержання високо очищеного препарату НК, який

розчиняють у спеціальному буферному розчині та надалі використовують у ПЛР.

Хаотропний агент, як це працює.

Визначення хаотропного агента - це речовина, здатна змінювати четвертинну, третинну та/або вторинну структуру білка або нуклеїнової кислоти без пошкодження первинної структури. Агент складається із солі (аніону), розчиненої у водному розчині. У вихідному методі Boom використовували солі тіоціанату гуанідинію, але також можуть використовуватися інші аніони, такі як іони брому, ацетату і нітрату.

Агент розуміє, що для поділу молекули води та нуклеїнової кислоти він повинен націлитись на фосфатну групу, яка утворює зв'язок між ними, і саме це він і робить! Він робить нуклеїнову кислоту повністю гідрофобною. Нуклеїнова кислота (зокрема тепер відкрита фосфатна група) адсорбується на кремеземі. Як тільки концентрація хаотропного агента зменшується, нуклеїнова кислота стає все більш і більш гідрофільною і розриває зв'язок із кремнеземом. Вона чіпляється за молекулу води, і вони відновлюють свій нековалентний зв'язок.

Стандартний склад набору реагентів для виділення ПК методом БУМУ:

 Лізуючий розчин – це буферний розчин хаотропного агента. Забезпечує лізис клінічного матеріалу, розчинення клітинних та вірусних частинок та вивільнення ДНК.

 Універсальний сорбент - суспензія кремнезему з розпушувачем у буферному розчині.

 Відмивний водно-спиртовий розчин - видаляє залишки лізуючого розчину з розчиненими інгібіторами ПЛР та іншими компонентами клінічного матеріалу.

 Буферний розчин ТЕ-буфер для елюції додается до підсушеної силіки розчиняє сорбовану на ній ДНК.

 Контрольні матеріали: IC та негативний внутрішні контролі (ВК).

У лабораторії з пробірки з клінічним зразком відбирається аліквота і переноситься в пробірку, в яку попередньо додані лізуючий розчин, універсальний сорбент та ВК. Після ретельного перемішування та інкубації центрифугують суспензію, осаджуючи сорбент з ДНК на дно, а супернатант видаляють. До обложеного сорбенту додають відмивальний розчин і повторно беруть в облогу сорбент. Залишки розчину для відмивання випарюють нагріванням пробірок з відкритими кришками. До осаду додають

стерильний буферний розчин, в якому розчиняється ДНК і центрифугують. В результаті виходить очищений препарат ДНК, який використовується реакції ампліфікації.

Прикладом таких наборів є реагенти від італійської компанії Sacace: DNA-Sorb, Ribo Sorb

Виділення на спин-колонках

Технологія виділення на спин-колонках - це вдосконалений метод екстракції на частинках силіки(сорбент кремнезему). У лужних умовах і при підвищених концентраціях солі ДНК зв'язується з силікатами, і це дозволяє відокремити решту всіх компонентів клітини від частинок силіки зі зв'язаною ДНК. Спин-колонки сконструйовані таким чином, що при нанесенні клітинного лізату на колонку та подальшому центрифугуванні ДНК залишається на колонці, а все зайве проходить крізь неї. Потім ДНК промивають кілька разів та елююють у пробірку для збору зразка.

Переваги такого методу полягають у підвищеній чистоті та хорошій якості виділених нуклеїнових кислот, високій відтворюваності та простоті. Екстракція на спин-колонках може зайняти від 20 хвилин залежно від біоматеріалу та складності його лізису. На ринку цей метод представлений великою різноманітністю наборів від таких відомих виробників, як Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher, Sacace (Genomic column DNA Express, Ribo-Virus), А1 (Viral DNA Isolation Kit, Genomic DNA Isolation Kit, Viral NA Isolation Kit) та інших. Вартість одного виділення тут значно вища, оскільки на кожну реакцію необхідна своя колонка, кілька пробірок

для збору фільтрату та елюату та, звичайно, реагенти.

Виділення на магнітних частинках

Сьогодні, більш ніж через 20 років після появи методу виділення на спин-колонках починає набирати популярність швидший спосіб виділення на магнітних частинках. Технологія цього способу виділення заснована на зв'язуванні нуклеїнової кислоти з речовиною, що покриває магнітні частинки (целюлоза, сефадекс, сефакрил, силіка, специфічні олігонуклеотиди та ін.). До клітинного лізату додають такі магнітні частинки і перемішують для зв'язування з ними ДНК.

Після цього пробірку ставлять магнітний штатив або підносять до магніту автоматичного приладу для виділення НК, фіксуючи таким чином тверду фазу. Після відбору супернатанту нуклеїнові кислоти на частинках промивають та елююють.Цей метод має ті ж переваги, що й виділення на спін-колонках, але для екстракції на магнітних

частинках не потрібне складне лабораторне обладнання (наприклад, центрифуга). Багато автоматичних станцій виділення засновані саме на цій методиці. Даний протокол виділення займе трохи менше часу завдяки відсутності етапів центрифугування, але кількість маніпуляцій буде приблизно такою самою. Також вартість однієї реакції зазвичай вища, ніж при виділенні на колонках, а панелі наборів надають Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher, Sacace (Magno-Virus/V), Bioron (RealLine Extraction 100, RealLine DNA - Extraction 3, RealLine Extraction UniMag, INSTANT Virus RNA/DNA) та інші.

Модифікований метод сорбції ATTOSORB®

Attosorb – це метод очищення ДНК, розроблений та запатентований компанією Attomol(Німеччина), при якому ДНК із зразка крові пацієнта зв'язується безпосередньо у лунках мікропланшета для ПЛР. На відміну від звичайних методів виділення ДНК молекулярно-генетичне виявлення проводиться за допомогою ПЛР у тій же лунці мікропланшета.

Кров з ЕДТА або цитрат піпеткою вносять в мікропланшет для ПЛР і потім лізують. ДНК, що міститься у зразку, зв'язується з твердою фазою мікропланшета для ПЛР, а надлишки матеріалу вимиваються. Для створення стандартизованих умов реакції при наступній ПЛР рідкі залишки, що залишилися після відсмоктування останнього розчину для промивання, висушують. Потім ДНК ампліфікують у тому ж мікропланшеті. Ця проста і швидка процедура в даний час призначена тільки для використання з тестовими лініями для молекулярної генетики Attomol Realtime TM 2 і Realtime LT.